Сейчас разберемся с его идеей:
ДНК состоит из двух идущих параллельно цепочек нуклеотидов. В нашем теле при каждом делении клетки эти цепочки начинают расплетаться при помощи специального белка — фермента — и на каждой отдельной цепочке дальше достраивается новая цепочка. Строится она из новых отдельных молекул — нуклеотидов. Так из одной двойной цепочки становится две новых двойных цепочки. Как повторить такой процесс в лаборатории?
Цепочки ДНК держатся вместе за счет водородных связей. Эти связи могут существовать только при определенной температуре. Если температуру поднять выше, то цепочки распадутся на две отдельные - денатурируют. Отлично, ведь это ровно то, что нужно.
Дальше в емкость с развалившимися ДНК молекулами надо добавить два компонента — праймеры — это такие коротенькие молекулы одноцепочечной ДНК, и собственно отдельно плавающие нуклеотиды. Праймеры нужны за тем, чтобы приклеиться к началу целевой цепочки ДНК, ведь к сожалению, она не умеет строится с ничего. Как многим художникам тяжело рисовать с совсем чистого листа. Чтобы праймер приклеился к целевой цепочке своими водородными связями, нужно снова опустить температуру в емкости, где происходит эта реакция. Шаг с приклеиванием праймера называется отжиг.
Когда праймер уже на месте, туда могут начать достраиваться другие нуклеотиды, создавая новую комплементарную цепочку на основе целевой молекулы ДНК. Так за один цикл реакции из одной цепочки уже получилось две. Этот шаг называется удлинение.
А теперь повторим все три шага последовательно и снова:
💡Поднимем температуру в емкости, где уже есть 2 двухцепочечные молекулы ДНК.
💡Добавим праймеры и опустим температуру, чтобы они смогли приклеиться на свои места.
💡Подождем, пока на каждой одиночной цепочке вырастет ее новая копия. На каждой из четырех отдельных цепочек. Теперь их стало 8.
Еще через цикл их станет 16, потом 32, затем 64, 128, 256… Для большинства современных исследований в среднем требуется 32-35 таких циклов, чтобы наработать очень много молекул ДНК, с которыми потом можно делать любые исследования. Вот это все и придумал в ту ночь и потом за много месяцев доработал Кэри Мулис.
Но была в этом всем одна мерзкая проблема. В выращивании новых цепочек ДНК обязательно должен участвовать один очень важный белок — полимераза. Без него ничего не работает. А при повышении температуры обыкновенная полимераза (в те годы использовали полимеразу из кишечной палочки) сворачивается. А обратно белки разворачиваться уже не умеют. Ваша утренняя яичница тому отличная иллюстрация. Так что в экспериментах Кэри Муллиса после каждого шага нагрева приходилось вручную добавлять в емкость новую порцию полимеразы. И так больше 30 раз, помните? То есть технология конечно работала, но была очень трудоемкой и медленной.
Уже в 1985 году та самая Cetus, где работал Муллис, в кооперации с компанией PerkinElmer создала прибор, который умел менять температуры, добавлять полимеразы и делать все это автоматически, соблюдая четкие тайминги. Такой прибор называется термоциклер, а с тех пор он претерпел множество перерождений. А следующий прорыв в автоматизации и убыстрении (и конечно удешевлении) ПЦР случился еще через 3 года, когда ученые обратились к открытию Фриза и Брока из далеких 60-х. На сцене уже прикладной науки появились термостабильные полимеразы, которые выделили как раз из той самой йеллоустоунской бактерии Thermus aquaticus. Бактерия и соответственно ее белки умели жить и работать при высоких температурах. Полимераза из нее выдерживала нагрев в термоциклере свыше 75 градусов Цельсия и так в течении множества циклов. Больше ничего не надо было останавливать ни на секунду, чтобы добавить в процесс новую порцию полимераз! Новые молекулы кроме всего прочего получались длиннее и точнее.
Кстати, с той поры биотех компании отправили множество исследовательских экспедиций, чтобы найти новых еще неизвестных науке обитателей гейзеров Йеллоустоуна с их удивительными свойствами. Парк об этом не переживает, получая с этого неплохое финансирование на поддержание своей работы и природоохранных проектов в нем.
